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当前位置:第七节 细胞呼吸
作者：未知来源：中央电教馆时间：2006/4/29 8:31:34阅读：nyq
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发酵工程
发酵工程是在微生物纯培养技术日益成熟、密闭式发酵罐设计成功的基础上，采用现代工程技术手段，利用某些微生物的特定生理功能，在人工控制的环境下生产有用的化学产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。
发酵工程的过程包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。
（一）发酵工程的工艺流程
1、菌种的选育
找到合适的菌种是发酵工程的前提。
人们最初是从自然界寻找所需要的菌种，如谷氨酸发酵时常用菌有谷氨酸棒状杆菌等。但这种方法得到的菌种，产量一般都比较低。20世纪40年代，微生物学家开始用紫外线、激光、化学诱变剂等处理菌种，使菌种产生突变，以筛选出符合要求的优良菌种，这种人工诱变育种选择菌种的方法已在氨基酸、核苷酸、某些抗生素等的发酵生产中获得成功。例如，不能合成高丝氨酸脱氢酶的黄色短杆菌就是用人工诱变的方法获得的，再有在1943年刚开始生产青霉素时，青霉素的含量只有20μg/mL左右，经过长期的诱变育种如今青霉素的含量已达到85000μg/mL以上。
随着细胞工程、基因工程等技术的日益成熟，科学家开始构建工程细胞或工程菌，用它们进行发酵，甚至能生产出一般微生物所不能生产的产品。例如，将大肠杆菌的质粒取出，整合上人生长激素的基因以后，重新植入大肠杆菌细胞内，利用带有人生长激素基因的工程菌进行发酵，可生产出大量的人生长激素。
2、菌种培养基的配制
培养基是选择出的菌种生活的环境，对菌种有多方面的影响，所以至关重要。一般来说，培养基的配方要经过反复的实验才能确定。
另外，发酵工程中所用的菌种多要求是纯培养的，即整个发酵过程不能混有杂菌，否则将导致产量大大下降，甚至得不到产品。例如，如果青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌会分泌青霉素酶，将形成的青霉素分解掉。因此，培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。
例如，谷氨酸发酵时常用菌有谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌等菌种，其培养液通常用豆饼(或马铃薯等)的水解液、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁、生物素（为生长因子，是维生素的一种，在肝、肾、酵母和牛乳中含量较多）等配制而成。培养液配制完成以后，投放到发酵罐中，通入98kPa的蒸汽进行灭菌，冷却后，在无菌条件下才能接种。
3、扩大培养和接种
在大规模的发酵生产中，需要将选育出的优良菌种经过多次扩大培养，让它们达到一定数量以后，再进行接种。
4、发酵过程
发酵过程一般是在发酵罐内进行的，发酵罐是一种圆柱形的容器，容量从几升到几百万升，罐上除有通气、搅拌、接种、加料、冷却等装置外，还有对温度、pH、通气量与转速等发酵条件进行检测和控制的装置。
发酵过程中环境条件的变化，不仅会影响菌种的生长繁殖，而且会影响菌种代谢产物的形成。为了使发酵过程能顺利进行，要随时取样检测培养液中的细菌数目、产物浓度，同时还要及时为发酵菌提供必需的营养，并严格控制温度、pH、溶氧量、通气量与转速等发酵条件。
味精的主要成分是谷氨酸的双钠盐，而谷氨酸以前通过植物蛋白质水解法生产。1957年，日本率先用微生物发酵法生产成功。下面以味精的发酵生产简单介绍一下谷氨酸的发酵过程。谷氨酸发酵用的菌种为谷氨酸棒状杆菌，它是好氧菌，所以发酵时要不断地通人无菌空气，并通过搅拌使空气形成细小的气泡，以增加培养基的溶氧量，当溶氧量不足时，生成的代谢产物就会是乳酸或琥珀酸而不是谷氨酸；搅拌的另一个作用是使菌种与培养液充分接触，提高原料的利用率；发酵温度控制在30~37℃、pH控制在7~8.0左右，当pH呈酸性时，谷氨酸棒状杆菌就会生成乙酰谷氨酰胺。经28~32小时，培养液中就会生成大量的谷氨酸，然后将谷氨酸从培养液中分离提取出来，通常每升培养液中能得到谷氨酸50~100g。提取出来的谷氨酸用适量的NaCO3溶液中和后，再经过过滤、浓缩、离心分离等步骤、最终制成味精。
现在，生物学家已可以通过计算机对发酵罐上的各种装置进行自动记录和自动控制。例如，对溶氧量的控制，可以通过通气和搅拌速度来调节；对温度控制，可以通过发酵罐上的温度自动测试、控制装置进行检测和调整；对pH的控制，可以通过加料装置，添加酸或碱进行调节，也可以在培养基中添加PH缓冲液等。
5、分离提纯
对发酵产品的要求不同，分离提纯的方法也相应有些区别，而且发酵产品要经过质量检查合格后，才能成为正式产品。利用发酵工程生产的产品有菌种代谢产物和菌种本身（如酵母菌和细菌）两大类。如果产品是菌种，分离方法一般是通过滤、沉淀其从培养液中分离出；如果产品是代谢产物，则采用蒸馏、萃取、离子交换等方法提取。分离提纯后的产品，还要经过质量检查合格后方可投入市场。
（二）发酵工程的应用
发酵工程优点原料来源丰富经济，产物专一，废弃物对环境的污染小或容易处理，因此在医药工业、食品工业、农业、冶金工业、环境保护等方面得到快速的发展，在一些发达国家，发酵工业的总产值占到国民生产总值的5%左右。我国也在20世纪80年代以后，大力地发展了发酵工业。
1、在食品工业上的应用
（1）通过发酵工程使一些传统的发酵产品，如啤酒、果酒、食醋等，使产品在产量和质量得到明显的提高。
（2）通过发酵工程生产的食品添加剂，改善了食品店品的品质及色、香、味。
例如，用发酵方法制得的L-苹果酸是国际食品界公认的安全型酸味剂，广泛用于果酱、果汁、饮料、罐头、糖果、人造奶油等的生产中。
（3）发酵工程有望为解决人类的粮食短缺问题开辟一条新的途径。
微生物含有丰富的蛋白质，如细菌的蛋白质含量占细胞干重的60%~80%，酵母菌的占45%~65%，而且它们的生长繁殖速度很快。因此，许多国家利用淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液、石化产品等为原料，通过发酵获得大量的微生物菌体，这种做生物菌体就叫做单细胞蛋白。20世纪80年代中期，全世界生产的单细胞蛋白已达2×106吨。用酵母菌等生产的单细胞蛋白可作为食品添加剂，甚至制成“人造肉”供人们直接食用。最近国外市场上出现的一种真菌蛋白食品，就以其高蛋白、低脂肪的特点受到了消费者的欢迎。单细胞蛋白用做饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。
2、在医药工业上的应用
发酵工程已广泛应用于医药工业上，很多抗生素、维生素、动物激素、药用氨基酸、核苷酸等都可通过发酵工程得到，其中，抗生素的生产占主要的地位。20世纪80年代，世界各地的抗生素年产量达2.5 x 104吨，产值超过40亿美元。目前，常用的抗生素已达一百多种，如青霉素类、头孢菌素类、红霉素类和四环素类。
有些药物如人生长激素、胰岛素，过去主要是靠从生物体器官、组织、细胞或尿液中提取，发酵工程为这些药物的生产量大大提高，已可满足普通人的需要。
随着基因工程和发酵工程结合应用，人们已可大批量生产人生长激素、重组乙肝疫苗、某些种类的单克隆抗体、白细胞介素-2、抗血友病因子、生长激素释放抑制因子等重要的药物。例如，生长激素释放抑制因子是一种人脑激素，能够抑制生长激素的不适宜分泌，用于治疗肢端肥大症。最初，生产生长激素释放抑制因子的方法是从羊脑中提取，50万个羊脑才能提取5mg，远远不能满足需要。而利用整合了生长激素释放抑制因子的基因的工程菌进行发酵生产，7.5L培养液就能得到5mg的生长激素释放抑制因子，而价格只有原来的几百分之一。
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细胞的呼吸作用
1、细胞呼吸的概念
无论是哪类生活细胞，都必须分解细胞内的有机物以获得能量来维持各项生命活动。细胞氧化有机物以获得能量并产生二氧化碳和水的过程称为细胞呼吸。细胞呼吸是一个复杂的，有多种酶对参与的多步骤过程。
如果选择适当的催化剂可以使葡萄糖一步氧化成水和二氧化碳，而实际上在细胞中，葡萄糖的氧化是要远非如此简单，而是经过许多步骤才完成的。其全程可概括地分为四个阶段：糖酵解，丙酮酸氧化脱羧，柠檬酸循环，氧化磷酸化。这些过程是由酶负责催化的一系列生物化学反应。
2、细胞呼吸全过程
（1）糖酵解：这是葡萄糖氧化的第一阶段，包括一系列的反应，都是在细胞质基质中发生，这时不需要氧的参与，每一反应都有特定的酶催化，经过这一过程的一系列反应，一分子葡萄糖（六碳化合物）最终分解为两分子的丙酮酸（三碳化合物），同时净产生2个ATP和2个NAD+还原成2个NADH+H+。具体而言，糖酵解可分为两个步骤：
①葡萄糖经过两次磷酸化，并且发生异构化以后，转变成1，6-二磷酸果糖。这就是说，一个六碳化合物变成带有两个磷酸的化合物。这一过程要消耗两分子ATP。
②1，6-二磷酸果糖是不稳定的化合物，它在醛缩酶的作用下，很容易分解成为两个磷酸丙糖，即磷酸二羟丙酮和磷酸甘油醛。这两者可以互相转化，处于平衡状态。当磷酸甘油醛进一步转化而被消耗掉的时候，磷酸二羟丙酮也就跟着转变为磷酸甘油醛，参加到以后的反应中去。由磷酸甘油醛转变为磷酸甘油酸的时候，脱出的氢被氧化型辅酶Ⅰ（NAD）携带着，成为还原型辅酶Ⅰ（NADH ＋ H＋）。在这个氧化过程中放出的能量被ATP携带着。以后在磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸的反应中也生成ATP。
在由葡萄糖到丙酮酸的整个过程中，能位是逐步下降的，但只有上述这两个反应的能位下降较大，足以生成ATP，其他反应则只有微小的下降，不足以生成ATP。因此一分子1、6_二磷酸果糖实际上可以形成两分子丙酮酸，共得到四分子ATP，但在糖酵解的开始阶段用掉两分子ATP，所以一分子葡萄糖经过糖酵解净得两分子ATP。
（2）丙酮酸氧化脱羧
葡萄糖经过酵解过程只释放出不足1/4的化学能，大部分还保留在2个丙酮酸分子和2个NADH中。丙酮酸是呼吸过程中的一个重要的中转站。在有氧条件下，它经脱羧氧化产生乙酰辅酶A后，可进入三羧酸循环进一步氧化分解放能；在无氧条件下，它被NADH还原成为乳酸，或者在脱去羧基（放出CO2）以后转变成为乙醛，乙醛再被还原成为乙醇
丙酮酸在进入三羧酸循环之前，先要氧化脱羧、脱氢，与辅酶A结合成为活化的乙酰辅酶A（乙酰-CoA）。这一过程是在线粒体基质中进行的，所产生的乙酰辅酶A即进入柠檬酸循环（又叫TCA循环、Krebs循环或三羧酸循环）。
（3）三羧酸循环
三羧酸循环的最初中间产物是柠檬酸（这是一种三羧基酸），所以这个过程又叫柠檬酸循环，还有为了纪念这一途径的发现者Hans Krebs，所以这个过程又叫Krebs循环。
这一过程也包括一系列的酶促反应，丙酮酸的3个碳在转变为乙酰辅酶A时脱去了1个，在通过这一循环中继续脱去2个，这样葡萄糖中的碳就被完全氧化了。柠檬酸循环发生在线粒体基质中，柠檬酸循环途径中的酶，除琥珀酸脱氢酶，定位于线粒体内膜外，其它酶存在于线粒体基质中。通过一次柠檬酸循环，由葡萄糖产生的2个乙酰辅酶A，共产生4个二氧化碳分子，6个NAHD分子，2个FADH2和2个GTP分子（底物磷酸化产生的）。
三羧酸循环的简化过程是：丙酮酸在经过氧化（脱氢）和脱羧（放出CO2）以后生成乙酰辅酶A（即乙酰CoA）。乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形成柠檬酸（C6）、柠檬酸脱水形成顺乌头酸，顺乌头酸加水再形成异柠檬酸；然后异柠檬酸氧化脱羧形成а-酮戊二酸（C5），а-酮戊二酸再氧化脱羧形成琥珀酸（C4），琥珀酸经过脱氢氧化最终成为草酰乙酸。草酰乙酸可以再与乙酞辅酶A相结合，再次进入二羧酸循环。这样下去，循环不已。这样每一分子葡萄糖经过糖酵解生成两分子丙酮酸，然后这两个丙酮酸氧化脱羧生成的乙酰辅酶A，都进入三羧酸循环、共产生六分子CO2。
在三羧酸循环中，一共发生5次脱氢，其中四次脱出的氢被NAD携带着，另一次（从琥珀酸）脱出的氢被黄酶（FAD）携带着，以后在氧化磷酸化过程中被被氧化为水。另外，在 а-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酸的时候、也形成一分子ATP。
在丙酮酸脱羧氧化和三羧酸循环的整个过程中，只有丙酮酸被彻底分解、其他酸不被彻底分解，所以它们只要有少量存在，就可以推动这个循环继续进行下去。其它的酸就象工厂里的传送带一样，把丙酮酸分子向前传送，并且逐步分解。
（4）氧化磷酸化
一分子葡萄糖经糖酵解中生成2分子NADH ，在丙酮酸氧化脱羧和三羧酸循环中共生成8个NADH和2个FADH2。NADH和FADH2中的高能电子沿着存在于线粒体内膜上的一系列电子传递体的氧化还原反应从高能水平向低能水平传递，最后传递到分子氧，最终还原性与氧结合而生成水。在这一过程，高能电子所释放的能量就通过磷酸而被储存在ATP中，ATP的形成是发生在线粒体内膜上的，这里发生的磷酸化作用是和氧化过程的电子传递密切相关，因而称为氧化磷酸化。存在于线粒体内膜上的一系列电子传递体称为电子传递链，氧分子是电子传递链中最后的电子受体。一个NADH分子经过电子传递后可生成3个ATP，而一个FADH2分子经过电传递后可生成2个ATP分子。
下面我们来计算一下细胞呼吸过程中能量的变化（以一分子葡萄糖为直接底物为例）
| 细胞呼吸过程 |
具体产生ATP的过程 |
产生ATP数量 |
|
糖酵解 |
葡萄糖分子活化 |
消耗2个ATP（—2） |
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底物磷酸化 |
产生4个ATP（4） |
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净积累 |
净产生2个ATP（2） |
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产生2个NADH |
无ATP产生 |
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| 丙酮酸氧化脱羧 |
产生2个NADH |
无ATP产生 |
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柠檬酸循环 |
底物磷酸化 |
产生2个GTP，相当于2个ATP（2） |
|
产生6个NADH |
无ATP产生 |
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|
产生2个FADH2 |
无ATP产生 |
|
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氧化磷酸化 |
糖酵解产生的产生2个NADH |
产生4或6个ATP（4或6） |
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丙酮酸氧化脱羧产生的产生2个NADH |
产生6个ATP（6） |
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柠檬酸循环产生的6个NADH |
产生18个ATP（18） |
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柠檬酸循环产生的2个 FADH2 |
产生4个ATP（4） |
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| 总计 |
一分子葡萄糖完全氧化为二氧化碳和水，共可产生ATP的数量为：36或38个。 |
3、细胞呼吸过程能量的转换率
通过上面的分析我们知道，每氧化1mol 的葡萄糖，生成6mol的二氧化碳和6mol的水，同时生成38mol 的ATP。1mol的ADP形成ATP，一般要求约30.5kJ的能量，那么38mol的ATP就要求：38×30.5=1159kJ的能量，注意课本中提到的数字是1161kJ。每氧化1mol葡萄糖所放出来的总能量是2870kJ，其中只有1159kJ被保留在ATP内，供给植物生命活动之用。所以呼吸作用的能量转化效率只有40.5%左右，其余部分的能量以热能状态散失掉了。我们应该认识到，细胞中这种能量转换率是比较高的，因为人类发明的内燃机，其热能转化率最高也就是在25%左右。